近年二代基因測序（next-generation sequencing，NGS）技術(shù)快速發(fā)展，其應用已進(jìn)展至臨床檢測，如遺傳疾病、實(shí)體腫瘤、血液腫瘤、感染性疾病、人類(lèi)白細胞抗原分析及非侵襲性產(chǎn)前篩查等。想完成這一系列檢測分析肯定離不開(kāi)一間功能完備的實(shí)驗室，那么，關(guān)于二代測序實(shí)驗室裝修都應注意什么？

實(shí)驗室總體要求

NGS檢測實(shí)驗室的總體設計與要求應參考《分子病理診斷實(shí)驗室建設指南（試行）》、《醫療機構臨床基因擴增檢驗實(shí)驗室工作導則》、《個(gè)體化醫學(xué)檢測質(zhì)量保證指南》、《腫瘤個(gè)體化治療檢測技術(shù)指南》、《個(gè)體化醫學(xué)檢測實(shí)驗室管理辦法》、《測序技術(shù)的個(gè)體化醫學(xué)檢測應用技術(shù)指南（試行）》進(jìn)行。

1、NGS檢測人員的資質(zhì)要求：NGS檢測技術(shù)人員應具備臨床病理學(xué)、分子生物學(xué)的相關(guān)專(zhuān)業(yè)大專(zhuān)以上學(xué)歷，并經(jīng)過(guò)NGS技術(shù)的理論與技能培訓合格。數據分析人員應具有臨床醫學(xué)或分子生物學(xué)或遺傳學(xué)知識背景并經(jīng)生物信息學(xué)培訓。最終報告應由中級或碩士以上具有病理學(xué)背景、經(jīng)培訓合格的本單位執業(yè)醫師或者授權簽字人(醫學(xué)博士學(xué)位或高級職稱(chēng))審核。

2、NGS檢測實(shí)驗室的區域設置要求：原則上NGS實(shí)驗室應當有以下分區：樣本前處理區、試劑儲存和準備區、樣本制備區、文庫制備區、雜交捕獲區/多重PCR區域（第一擴增區）、文庫擴增區（第二擴增區）、文庫檢測與質(zhì)控區、測序區、數據存貯區。各工作區空氣及人員流向需要嚴格按照《醫療機構臨床基因擴增檢驗實(shí)驗室工作導則》。分區可根據實(shí)際情況合并，但是在前處理和建庫時(shí)，血液樣本應與組織樣本分開(kāi)。

3、NGS檢測試劑及項目要求：試劑和測序平臺均應選擇中國食品藥品監督管理總局(CFDA)認可產(chǎn)品。涉及到實(shí)驗室自配試劑，應該有嚴格的試劑制備標準操作規程（SOP），需經(jīng)過(guò)臨床實(shí)驗室自建項目(LDT)驗證合格才可使用。每個(gè)NGS檢測項目在驗證時(shí)需要根據建庫方法、測序平臺和分析工具以及不同的突變類(lèi)型包括，單堿基突變single nucleotidevariant，SNVs、小片段插入或者缺失（Indels）、基因拷貝數變異Copynumber variations（CNVs）、染色體結構變異，structuralvariation（SVs）以及不同的樣本類(lèi)型（如FFPE組織、新鮮組織、全血、胸水等）對特定panel的準確性、精確性、敏感性、特異性等性能參數進(jìn)行LDT驗證。應該有經(jīng)過(guò)標準品測試的在不同的mutant allele frequencies（MAF）下，不同測序深度的靈敏度及特異性數據，確定不同樣本的可信的測序深度。經(jīng)驗證后，SOP發(fā)生的任何改動(dòng)，包括試劑、儀器、基因項目等都需要重新做驗證。驗證實(shí)驗結果簽名留底備案。

4、NGS檢測實(shí)驗室的質(zhì)量管理要求：NGS檢測主要包括實(shí)驗操作和生物信息

學(xué)分析兩部分。實(shí)驗操作部分包括樣本準備、文庫制備、編碼（barcoding）、目標區域富集、測序等；生物信息學(xué)分析部分包括定位（mapping）、比對、變異識別、變異注釋、變異解讀及報告等。上述流程均需要建立實(shí)驗室質(zhì)量管理體系文件和SOP及機器運行和維護SOP，具有嚴格的室內質(zhì)控措施；定期參加室間質(zhì)評以有及持續的質(zhì)量保證和改進(jìn)計劃。

NGS分析樣本、基因panel和轉運要求

NGS分析樣本類(lèi)型可采用FFPE樣本、新鮮組織、各種體液上清液、體液離心細胞塊石蠟包埋標本和血漿/血液標本等。

對于腫瘤體細胞變異初次NGS檢測應首選經(jīng)病理評估的組織樣本，在此數據基礎上的再次檢測可選取液體樣本動(dòng)態(tài)監測。

NGS檢測前需通過(guò)病理診斷明確其腫瘤的性質(zhì)及含量，根據不同腫瘤類(lèi)型選擇合適的基因panel測序。

不同疾病的基因panel列表，必須由臨床與檢測機構的專(zhuān)家共同決定，已達到不同實(shí)驗室之間的可比性和完善性。

未經(jīng)病理評估的基因檢測結果不可單獨用于分子病理臨床診斷目的。

樣本質(zhì)量對檢測結果和分析至關(guān)重要，病理醫師需要對可評估的樣本進(jìn)一步明確病理診斷，并評價(jià)標本有無(wú)出血、壞死和不利于核酸檢測的前處理（例如含HCl脫鈣液處理），病變細胞（如腫瘤細胞）的總量和比例，避免假陰性。組織標本中腫瘤細胞含量建議達到20%以上，低于此標準可富集后檢測。

NGS檢測實(shí)驗室應對不同類(lèi)型的樣本有采集及處理SOP指導。對于不同的樣本（FFPE、體液、血液等）實(shí)驗室應有不同的樣本運送SOP，物流環(huán)節（含冷鏈運輸）應有相關(guān)運送記錄，確保樣本運送安全、無(wú)污染、無(wú)降解。

NGS檢測流程中的質(zhì)量標準

1、核酸提取及其質(zhì)量分析：提取的核酸質(zhì)量是NGS檢測成功的關(guān)鍵因素，在制備文庫前應采用多種方法對核酸質(zhì)量評估，包括純度、濃度和完整性分析。需要根據不同的樣本類(lèi)型制定相應的SOP用以鑒定核酸的純度、濃度、完整性或降解程度等。并對應明確接受和拒絕的標準。

2、文庫制備及其質(zhì)量分析：文庫制備方法主要有雜交捕獲和擴增子建庫，無(wú)論采用何種方法制備文庫和平臺檢測，都應對檢測基因、區域或突變熱點(diǎn)進(jìn)行描述，并建立實(shí)驗室檢測SOP。建立好文庫后上機測序前需對文庫進(jìn)行質(zhì)量分析。每個(gè)檢測項目應設定其文庫質(zhì)量的要求，明確接受或拒絕的標準。

3、NGS測序儀上機分析及其質(zhì)量分析：NGS建庫主要有擴增法和捕獲法兩大策略，測序時(shí)根據檢測樣本量和質(zhì)量要求確定適當的芯片，以保證測序質(zhì)量和靶區覆蓋深度。錄入樣本編號、檢測內容、設定參數等信息，按儀器操作流程進(jìn)行測序。產(chǎn)生的測序數據質(zhì)量參數要求詳見(jiàn)后文。

4、NGS檢測中的樣本追蹤及對照設置：（1）樣本追蹤：為確保檢測過(guò)程中樣本沒(méi)有混淆或污染，可選用多個(gè)SNV位點(diǎn)或其他標簽作為樣本身份標識（sample ID），在檢測前對每個(gè)樣本進(jìn)行SNV位點(diǎn)信息的測定，在NGS檢測后對上述位點(diǎn)進(jìn)行追蹤，證明沒(méi)有交叉污染。（2）陽(yáng)性對照：應用組合型質(zhì)控材料，可采用已知突變信息的混合樣本，以模擬樣本的復雜性。實(shí)驗時(shí)同時(shí)檢測，以確保其檢出能力。（3）陰性對照：用無(wú)核酸或明確無(wú)突變的樣本作為模板同時(shí)進(jìn)行檢測，以確保檢測過(guò)程中沒(méi)有污染或非特異性。（4）應對方案和替代方法：各個(gè)質(zhì)量控制步驟中如出現異?；蚴?，實(shí)驗室應有應對措施或備選方案；對于測序結果質(zhì)量差或有問(wèn)題的區域應建立替代方法（如Sanger測序）。

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