之前碰到過(guò)一些客戶(hù)，說(shuō)做PCR實(shí)驗總是出現假陽(yáng)性，明明沒(méi)有加模板最后卻擴出了產(chǎn)物。如果這種現象頻頻出現，就要注意一下操作環(huán)境了。如果你去百度上搜索“PCR出現假陽(yáng)性了怎么辦”，下面給出的建議一定會(huì )有防止交叉污染這條建議。有人說(shuō)模板DNA是大分子，溶于去離子水中，怎么會(huì )無(wú)緣無(wú)故跑出來(lái)污染環(huán)境呢？

這里涉及一個(gè)氣溶膠的概念，氣溶膠是由固體或液體小質(zhì)點(diǎn)分散并懸浮在氣體介質(zhì)中形成的膠體分散體系，能在空氣中滯留至少幾個(gè)小時(shí)。PCR反應過(guò)程中不斷進(jìn)行升溫降溫，液體蒸發(fā)又冷凝，PCR管中空氣的部分形成了氣溶膠，攜帶了大量DNA擴增產(chǎn)物（注意1ng擴增產(chǎn)物中可作為模板的DNA片段的數量超過(guò)1ng起始模板中可擴增DNA片段數量的幾百萬(wàn)倍甚至更高。比如人的基因組DNA有30億個(gè)bp，要擴增的單拷貝基因片段是300 bp，1ng起始模板中可以作為模板DNA片段只占總起始模板DNA總量的千萬(wàn)分之一）。如果在實(shí)驗室打開(kāi)含PCR擴增產(chǎn)物的管蓋，大量攜帶DNA擴增產(chǎn)物的氣溶膠就會(huì )涌出，擴散到空氣中，從而對環(huán)境造成污染。雖然在整個(gè)空間環(huán)境中DNA的含量很低，但是由于理論上只要有1個(gè)可做為模板的DNA 片段也能PCR擴增成功，這就是為什么在污染環(huán)境中陰性對照也能擴增出條帶的原因。

所以在專(zhuān)業(yè)的PCR實(shí)驗（比如臨床PCR檢驗實(shí)驗室）室通常有四區隔離（或至少是三區隔離）的要求。

常見(jiàn)的三區指的是：

1、試劑配制區：PCR反應體系的配制區域。

2、標本處理區：包括擴增模板的制備，也就是我們常常提取DNA的地方；

3、PCR擴增和產(chǎn)物分析區：進(jìn)行PCR擴增的區域，也是擴增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析的區域。

此外，如果將PCR擴增區域和產(chǎn)物分析區再次分開(kāi)，就是四區隔離了。

四區隔離，主要目的是防止氣溶膠在各個(gè)PCR區域之間的流動(dòng)—最好的方法是干脆每個(gè)區域隔一幢樓，那肯定是最佳的隔離措施了，但操作起來(lái)肯定不現實(shí)，于是便有了針對不同區域設置正負壓的方法：

試劑配制區（Ⅰ區）：最潔凈的區域，保持微正壓使得外界空氣無(wú)法進(jìn)入隔離污染源。并且陰性模板應該在此區加入PCR管并蓋蓋，嚴禁在此區域打開(kāi)、存放裝有DNA模板的離心管；

DNA模板添加區（Ⅱ區）：保持微負壓，保證內部空氣不外泄，以免陽(yáng)性模板的氣溶膠對外界環(huán)境造成污染。

擴增及PCR產(chǎn)物分析區（Ⅲ區）：保持微負壓，使得內部空氣不外泄，以免擴增產(chǎn)物的氣溶膠對外界環(huán)境造成污染。

操作時(shí)遵循Ⅰ區→Ⅱ區→Ⅲ區單一方向進(jìn)行，不可逆向進(jìn)行。

對于科研用途的PCR實(shí)驗室，如果無(wú)法達到嚴格的三區隔離的要求，至少也要做到兩區隔離：即正壓區和負壓區。正壓區實(shí)施Ⅰ區的功能，負壓區實(shí)施Ⅱ區，Ⅲ區的功能。

最忌諱也是最可怕的是反過(guò)來(lái)，在正壓區實(shí)施Ⅲ區的功能。PCR實(shí)驗室不同區域間的空氣是互相之間否有流通是關(guān)鍵所在。

如果有問(wèn)，我們的實(shí)驗室沒(méi)有正負壓的區分，或者是全負壓，全正壓怎么辦呢？那我們的建議是：別怕麻煩，找個(gè)遠離Ⅲ區（通俗地講就是打開(kāi)PCR擴增產(chǎn)物的蓋子區域，比如電泳區）的實(shí)驗室當做PCR I區使用，能省掉后續更多的麻煩。

既然PCR三區隔離的目的是為了阻斷氣溶膠的交流，請注意以下細節，思考一下氣溶膠來(lái)自哪里：

1. 每個(gè)區域都應配備專(zhuān)用的移液器，不可交叉混用。

2. 每個(gè)區域都應配備專(zhuān)用的移液器吸頭，不可交叉混用。

3. 如果條件允許，在PCRⅢ區工作結束后再次進(jìn)入PCR I區需要更換實(shí)驗服、一次性鞋套、帽子、手套。

4. 在PCR I區、PCRⅡ區配備帶濾芯吸頭。